Zijn vroege onderzoek betrokken zijn op het gebied van stralingsdetectie, en bouwde Geiger tellers hiervoor. Aan de universiteit van Warschau studeerde hij inelastische botsingen en ontdekte de aanwezigheid van Kobalt 60 (een radioactief isotoop) in experimenten waarin hij bombarderen goud met neutronen.
Neils Bohr, een toonaangevende kernfysicus en een pionier in de gebied van nucleair onderzoek, suggereerde dat uranium 235 was het element verantwoordelijk voor kernsplitsing, en in 1939 het idee van een kernsplijting bom werd bedacht. Rotblat trad Chadwick in Liverpool, en werd erkend voor zijn capaciteiten samen met zijn opmerkelijke collega's.
Op 1 september 1939 viel Duitsland Polen en de oorlog werd verklaard. Helaas, Rotblat's vrouw, Tola, werd opgesloten in Polen ondanks zijn pogingen om haar te redden. Tola onvermijdelijk stierf in het concentratiekamp Majdanek in Polen.
Rotblat was niet op de hoogte van haar dood tot 1945; Hij werd verwoest door dit nieuws. Wegens zijn nabijheid en persoonlijke ervaring met de rampzalige en verwoestende gevolgen van Hitlers regime, Rotbalt vond dat Hitler moest worden afgeschrikt. In feite, gaf hij de haalbaarheid van een uranium brandstof bom Chadwick. Hij worstelde met zijn geweten want hoewel hij voelde dat het was noodzakelijk om de Hitlers aanval af te schrikken, voelde hij zich sterk dat het niet zijn taak om te werken aan een dergelijk massavernietigingswapen.
Uiteindelijk Rotblat werd uitgenodigd om toetreden tot het Manhattan Project in de VS en hij accepteerde. Hij verhuisde naar de Los Alamos Labs in New Mexico in 1943. Hij werkte in het Oak Ridge Lab gespecialiseerd in uraanisotopenscheiding - een cruciale stap in het maken van de bom. Het Manhattan Project was onder leiding van Robert Oppenheimer en had deze opmerkelijke wetenschappers aan boord als Edward Teller, Richard Feynman en Enrico Fermi. Vroeg op, Rotblat had ambivalent gevoel over zijn betrokkenheid bij het project.
Hij woonde ooit een vergadering waarin General Groves, militaire hoofd van het Manhattan Project, verklaarde dat de voornaamste reden voor de ontwikkeling van de bom te verslaan Stalin en onderwerpt de Sovjets. Deze uitleg onrustige Rotblat, want het leek geen verbinding met nazi-Duitsland te hebben. Daarnaast concludeerde